麻疹病毒和風(fēng)疹病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：麻疹病毒和風(fēng)疹病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）
【包裝規(guī)格】10人份/盒，20人份/盒，50人份/盒。
【預(yù)期用途】
本品用于定性檢測(cè)咽拭子樣本中麻疹病毒(MV)和風(fēng)疹病毒(RV)核酸。
麻疹病毒是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科麻疹病毒屬。麻疹是一種由麻疹病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、出疹、咳嗽。
風(fēng)疹病毒是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，為單股正鏈RNA病毒，風(fēng)疹是一種由風(fēng)疹病毒引起的急性發(fā)熱出疹傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和出疹，包括先天性感染和后天獲得性感染。臨床上以前驅(qū)期短、低熱、皮疹和耳后、枕部淋巴結(jié)腫大為特征。
麻疹和風(fēng)疹均是通過(guò)呼吸道傳染，以急性發(fā)熱出疹為特征的傳染病，常出現(xiàn)流行或爆發(fā)，嚴(yán)重危害兒童和青少年的健康。從臨床表現(xiàn)上風(fēng)疹、麻疹與其它發(fā)熱出疹性疾病難以鑒別。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法目前主要有病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)等。
【檢驗(yàn)原理】
本品采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，以麻疹病毒和風(fēng)疹病毒基因組保守區(qū)作為擴(kuò)增靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在一個(gè)反應(yīng)體系中定性檢測(cè)樣品是否含有麻疹病毒或者風(fēng)疹病毒核酸。本品含有內(nèi)標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)可監(jiān)控核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增過(guò)程，避免出現(xiàn)假陰性檢測(cè)結(jié)果。
【主要組成成分】
組份名稱 主要成分 規(guī)格及數(shù)量（單位：支）
  10人份/盒 20人份/盒 50人份/盒
反應(yīng)液A 引物、探針、dNTP、Mg2+、K+。 180μl×1 360μl×1 900μl×1
反應(yīng)液B 反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、甘油。 35μl×1 65μl×1 160μl×1
陽(yáng)性對(duì)照 含麻疹病毒和風(fēng)疹病毒特異性片段的質(zhì)粒。 20μl×1 50μl×1 100μl×1
陰性對(duì)照 經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的純化水。 500μl×1 500μl×1 500μl×1
【儲(chǔ)存條件及有效期】
避光-20±5℃儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。
反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過(guò)10次，開(kāi)封后-20℃下三個(gè)月內(nèi)用完。生產(chǎn)日期及失效日期見(jiàn)標(biāo)簽。
【適用儀器】
ABI7500、Stratagene Mx3000P、Bio-Rad CFX96熒光PCR儀。
【樣本要求】
適用標(biāo)本類型為咽拭子。
樣本采集：將無(wú)菌棉拭子稍蘸生理鹽水，反復(fù)涂抹患者咽部數(shù)次，然后將棉拭子浸于1 mL～2 mL標(biāo)本維持液（含500～1 000單位（Unit，U）/mL青霉素、500 μg/mL～1 000 μg/mL鏈霉素和2％牛血清DMEM液）或者VTM中，并反復(fù)擠壓后，棄棉拭子。
樣本采集后應(yīng)及時(shí)檢測(cè)，-20±5℃保存期6個(gè)月，-70℃可以長(zhǎng)期保存。樣本避免反復(fù)凍融，如不可避免，反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過(guò)5次，采用低溫運(yùn)輸。
【檢驗(yàn)方法】
1. 樣本處理（樣本制備區(qū)）
用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit（貨號(hào)：52904）或者本公司的核酸提取試劑盒（貨號(hào)：HT5025，備案號(hào)：粵珠械20140038號(hào)）提取RNA，按說(shuō)明書(shū)操作。
2. PCR試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
從試劑盒中取出反應(yīng)液A、反應(yīng)液B，室溫融化后振蕩混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒后使用。
取N個(gè)（N=待測(cè)樣本數(shù)+陰性對(duì)照+陽(yáng)性對(duì)照）PCR反應(yīng)管，每管反應(yīng)液配制如下表：
反應(yīng)液組份 加量（μl）/人份
反應(yīng)液A 17
反應(yīng)液B 3
總體積 20
將各組份充分混合后，瞬時(shí)離心數(shù)秒。
3. 加樣（樣本制備區(qū)）
向上述對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管中分別加入提取的待測(cè)樣本RNA、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各5μl，蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。
4. PCR擴(kuò)增檢測(cè)（擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)）
4.1  將反應(yīng)管放入熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。
4.2  循環(huán)參數(shù)設(shè)定（請(qǐng)參照各類儀器的操作說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置）
步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù)（次）
1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 47℃ 30min 1
2 預(yù)變性 95℃ 10min 1
3 變性 95℃ 10s 45
4 退火、延伸及收集熒光 56℃ 45s 
步驟4中56℃時(shí)熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道：ROX / Texas Red通道為內(nèi)標(biāo)，F(xiàn)AM通道為麻疹病毒， HEX/ VIC通道為風(fēng)疹病毒。
在ABI7500熒光PCR儀中不選ROX校正，淬滅基團(tuán)選None。
4.3  結(jié)果分析
反應(yīng)結(jié)束后需要通過(guò)調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值，點(diǎn)擊Analysis自動(dòng)獲得分析結(jié)果。
【陽(yáng)性判斷值或者參考區(qū)間】
采用受試者工作曲線（ROC）確定本試劑盒的麻疹病毒的陽(yáng)性判斷值為Ct＜38；風(fēng)疹病毒的陽(yáng)性判斷值為Ct＜38。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
質(zhì)量控制
1. 陰性對(duì)照：無(wú)典型S型擴(kuò)增曲線顯示；
2. 陽(yáng)性對(duì)照：FAM和HEX檢測(cè)通道均呈典型S型曲線且Ct值≤30，同時(shí)ROX檢測(cè)通道有
或無(wú)擴(kuò)增曲線；
3. 以上要求需要在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。
結(jié)果判讀
1. 陰性結(jié)果的判讀：
如果FAM、HEX檢測(cè)通道無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct≥40，ROX檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線，可判樣品為麻疹病毒、風(fēng)疹病毒陰性；
2. 陽(yáng)性結(jié)果的判讀：
如果FAM檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct＜38，ROX檢測(cè)通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線，可判樣品為麻疹病毒陽(yáng)性；
如果HEX檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct＜38，ROX檢測(cè)通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線，可判樣品為風(fēng)疹病毒陽(yáng)性；
3. 可疑結(jié)果的判讀：
如果FAM檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且38≤Ct＜40，ROX檢測(cè)通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線，則該樣品需要進(jìn)行復(fù)測(cè)，如復(fù)測(cè)結(jié)果FAM的Ct值仍然在38~40范圍，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，可判樣品為麻疹病毒，否則樣品為麻疹病毒陰性。
如果HEX檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且38≤Ct＜40，ROX檢測(cè)通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線，則該樣品需要進(jìn)行復(fù)測(cè)，如復(fù)測(cè)結(jié)果HEX的Ct值仍然在38~40范圍，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，可判樣品為風(fēng)疹病毒陽(yáng)性，否則樣品為風(fēng)疹病毒陰性。
【檢驗(yàn)方法局限性】
1. 樣本收集、處理、運(yùn)輸及保存的失誤都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果；
2. 樣本處理時(shí)發(fā)生交叉污染，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
3. 病毒的基因突變也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
4. 本方法由于引物探針較多，可能形成引物二聚體導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
1. 最低檢測(cè)限：麻疹病毒/風(fēng)疹病毒均為5TCID50/ml。 
2. 精密性：批內(nèi)精密度變異系數(shù)≤5%，批間精密度變異系數(shù)≤5%，。
3. 特異性：本品與登革病毒、乙型腦炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV弓形蟲(chóng)、巨細(xì)胞病毒、I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒未見(jiàn)交叉反應(yīng)，與其他病原體反應(yīng)尚無(wú)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
4. 亞型檢測(cè)能力：可檢出麻疹病毒H1a、A、B3、D8、D9型，風(fēng)疹病毒2B、1E型，其他型別尚無(wú)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
5. 干擾性試驗(yàn)：常見(jiàn)干擾物質(zhì)如青霉素、地塞米松、維生素C、撲熱息痛、血液、膿液、病毒靈在檢驗(yàn)樣本中的濃度分別為20μg/ml、0.3μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、25%、25%、200mg/ml時(shí)，不會(huì)影響到樣本檢測(cè)結(jié)果。
6. 本品在臨床試驗(yàn)中檢測(cè)596份咽拭子樣本，與參比方法比較：
對(duì)于麻疹檢測(cè)，靈敏度為100%、特異度為95.7%、粗一致性為97.5%。
對(duì)于風(fēng)疹檢測(cè)，靈敏度為100%，特異度為97.1%，粗一致性為97.6%。
【注意事項(xiàng)】
1. 本品為體外診斷試劑，操作人員應(yīng)進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)并具備一定的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)；
2. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性請(qǐng)使用已校準(zhǔn)的移液器，實(shí)驗(yàn)用具（一次性PCR反應(yīng)管、吸嘴、離心管等）需選用去RNA酶處理過(guò)的產(chǎn)品；
3. 實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)），各區(qū)物品、工作服均為專用，不得交叉使用，實(shí)驗(yàn)后要及時(shí)進(jìn)行清潔；
4. 樣品處理必須在生物安全柜中進(jìn)行，以保護(hù)操作人員安全并防止環(huán)境污染；
5. RNA樣本應(yīng)保存于-70℃冰箱中，加樣前應(yīng)在室溫充分融化、混勻并瞬時(shí)離心后使用；
6. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。不同批號(hào)的試劑切勿混用，在有效期內(nèi)使用試劑盒；
7. MV/RV PCR反應(yīng)液A與MV/RV PCR反應(yīng)液B混合后，應(yīng)盡快完成實(shí)驗(yàn)，否則隨著時(shí)間延長(zhǎng)而擴(kuò)增效果變差；
8. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中佩戴一次性口罩和一次性頭套，勤換一次性薄膜手套；
9. 觸摸PCR管時(shí)切忌戴乳膠手套，防止汗液或乳膠手套上的粉末等影響熒光值檢測(cè)；
10. 反應(yīng)液加入模板后應(yīng)顛倒混勻，輕彈管壁去除氣泡，瞬時(shí)離心；
11. 使用過(guò)的吸嘴應(yīng)打入盛有10%次氯酸鈉的廢液缸中，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后與其他廢棄物一同集中處理；
12. 擴(kuò)增完畢后應(yīng)小心取出PCR管放入密封袋中，嚴(yán)禁在PCR實(shí)驗(yàn)室開(kāi)蓋，如果開(kāi)蓋，氣溶膠會(huì)對(duì)PCR室造成污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；
13. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)用10%次氯酸鈉或75%酒精處理工作臺(tái)和移液器，然后紫外照射30分鐘；
14. 本品涉及的待測(cè)樣本應(yīng)視為具傳染性物質(zhì)，避免直接接觸身體。樣本操作和處理均需符合衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療器械管理?xiàng)l例》相關(guān)要求；
15. 本品的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)僅在風(fēng)疹病毒、麻疹病毒檢測(cè)均為陰性時(shí)作為對(duì)采樣及提取效果的評(píng)價(jià)，當(dāng)出現(xiàn)風(fēng)疹病毒、麻疹病毒陽(yáng)性時(shí)，內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)與否不影響結(jié)果的判讀。
【標(biāo)識(shí)的解釋】
                                                
  溫度限制      體外診斷醫(yī)療器械       參考使用說(shuō)明       不得二次使用
【參考文獻(xiàn)】
Mosquera Mdel M，de Ory F，Moreno M，Echevarria JE．Simultaneous detection of measles virus，rubella virus，and parvovirus B19 by using multiplex PCR．J Clin Microbiol，2002，40(1)：111-116．
【基本信息】
注冊(cè)人/生產(chǎn)企業(yè)名稱：珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司
住所：珠海市唐家灣鎮(zhèn)港灣大道創(chuàng)新四路18號(hào)         郵政編碼：519085
聯(lián)系方式：電話號(hào)碼：0756-3890858             傳真號(hào)碼：0756-3890848
生產(chǎn)地址：珠海市唐家灣鎮(zhèn)港灣大道創(chuàng)新四路18號(hào)     郵政編碼：519085
生產(chǎn)許可證編號(hào)：粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20040941號(hào)
【醫(yī)療器械注冊(cè)證書(shū)編號(hào)/產(chǎn)品技術(shù)要求編號(hào)】國(guó)械注準(zhǔn)20183400480
【說(shuō)明書(shū)核準(zhǔn)日期及修改日期】2018.11.07